Pembiakan Bacteri Agrobacterium dalam Medium YEP Untuk Transformasi DNA

Efendi

A.  Buatlah larutan YEP medium sebanyak 1.0 L

• Masukkan magnetik pengaduk ke dalam beaker gelas berukuran 1 liter
• Masukkan DW(destiled water) sebanyak 800 ml
• Letakkan diatas pengaduk Magnetic stirer pas ditengah dan set putarannya
• Timbang dan masukkan bahan sbb:
 
• Bacto trypton                10.0  g
• Bacto yeast extract       10.0  g
• NaCl                              5.0  g
• 1 M MgCl₂                     2.0  ml
• Glucose                          1.0  g

• Tambahkan DW sampai mencapai volume 1.000 ml
• Aduk dengan magnetic stirer pada posisi 5 sekitar 5 menit
• Ukur dan sesuaikan pH 7.0 - 7.2
• Tutup beaker gelas dengan alumanium foil
• Sterilkan dalam autoclave pada suhu 120⁰C selama 20 menit (memerlukan waktu 1.5 - 2 jam).
• Catatan: Perhatikan jumlah air dalam autoclave jangan sampai kering(terlalu sedikit).

B. Membuat stock larutan antibiotik Kanamaycin 50 ppm (50 mg/liter)

• Ambil 5 ml DW dengan pipet/gelas ukur dan masukkan kedalam beaker gelas, bersama batang pengaduk
• Timbang Kanamycin 250 mg, masukkan kedalam DW yang telah dipersiapkan.
• Aduk dengan magnetic stirer pada posisi 5 sekitar 5 menit
• Saring dengan micro filter
• Pindahkan ke eppondorf tube berukuran 1.5 ml.
• Simpan pada suhu -20^oC dalam Freezer.

C. Pembiakan Bacteri Agrobacterium

• Tambahkan 50 ul Kanamycin kedalam 50 ml YEP medium (konsentrasi kanamycin 0.5%)
• Goyangkan hingga tercampur rata dan bekerjalah dalam Clean Bench/Laminar Flow.
• Bawa stock Agrobacterium dari Freezer (-80^oC) dengan memakai box berisi es pasir
• Ambil larutan bacteri tersebut dengan pipet sebanyak 50 ul, masukkan kedalam YEP medium.
• Aduk hingga terlarut dan tutup kembali dengan alumanium foil.
• Inkubasikan pada suhu 28^oC selama 1 malam (18 - 24 jam) dengan menggunakan shaker 210 rpm hingga diperoleh koloninya.
• Koloni bakteri siap digunakan untuk transformasi DNA