Pembiakan E. coli dalam LB Medium dan Ekstarksi DNA

Efendi

A.  Buatlah larutan LB medium sebanyak 500 ml sbb:

• Masukkan batang pengaduk ke dalam beaker gelas
• Masukkan DW(destiled water) sebanyak 400 ml
• Letakkan diatas pengaduk Magnetic stirer pas ditengah dan set putarannya
• Timbang dan masukkan bahan sbb untuk Medium cair:
 
• Bacto trypton                5.0  g
• Bacto yeast extract        2.5  g
• NaCl                             2.5  g
• Glukose                         0.5  g
• Timbang dan masukkan bahan sbb untuk Medium agar:
 
• Bacto trypton                5.0  g
• Bacto yeast extract        2.5  g
• NaCl                             2.5  g
• Glukose                         0.5  g
• Agar 7.5 g
• Tambah DW hingga mencapai volume 500 ml
• Aduk dengan magnetic stirer pada posisi 5 sekitar 5 menit
• Tutup beaker gelas dengan allumanium foil
• Sterilkan dalam autoclave pada suhu 120⁰C selama 20 menit (memerlukan waktu 1.5~2 jam).
• Note: Perhatikan jumlah air dalam autoclave, jangan sampai kering.

B. Membuat larutan antibiotik Kanamaycin

• Ambil 5 ml DW dengan pipet/gelas ukur dan masukkan kedalam beaker gelas, bersama batang pengaduk
• Timbang Kanamycin 250 mg, masukkan kedalam DW yang telah dipersiapkan.
• Aduk dengan magnetic stirer pada posisi 5 sekitar 5 menit
• Saring micro filter
• Pindahkan ke eppendorf tube berukuran 1.5 ml
• Simpan pada suhu -20^oC dalam Freezer.

C. Pembiakan Bacteri Agrobacterium

• Tambahkan 50 ul Kanamycin kedalam 50 ml LB medium (konsentrasi kanamycin 0.5%), goyangkan hingga tercampur rata dan bekerjalah dalam Clean Bench/Laminar Flow.
• Bawa stock Agrobacterium dari Freezer (-80^oC) dengan memakai box berisi es pasir
• Ambil larutan bacteri tersebut dengan pipet sebanyak 250 ul, masukkan kedalam LB medium, aduk hingga terlarut dan tutup kembali dengan alumanium foil.
• Inkubasikan pada suhu 28^oC selama 1 hari dengan menggunakan shaker 210 rpm hingga diperoleh koloninya.

D. Ekstraksi DNA Bacteri

• Masukkan koloni bakteri kedalam tabung sentrifugasi dan tutup dengan rapat
• Centrifugasikan pada 3.000 rpm selama 10 menit
• Buang bagian beningnya, hingga diperoleh pelet bacteri saja.
• Suspensikan dengan menambah 200 ul Larutan I, yang mengandung:
 
• 50 mM glucose
• 10 mM EDTA
• 25 mM Tris HCl
• 4 mg/m Lysozyme (boleh tidak ada)
• Pindahkan ke Ependoff Tube
• Tambahkan 400 ul Larutan II, yang mengandung:
 
• 1% SDS
• 0.2N NaOH

• Bagikan kedalam 2 tube
• Tambahkan 30 ul alkali fenol dan campur dengan vortex
• Tambahkan dengan segera 300 ul 0.3M NaOc (sodium acetat pH 4.8)
• Campurkan dengan membalik-balikkannya
• Tempatkan pada suhu -20^oC selama 20 menit
• Centrifugasikan 5 menit
• Ambil bagian beningnya saja
• Tambahkan 400 ul fenol chloroform dan segera campur dengan vortex
• Centrifugasikan 5 menit
• Ambil bagian yang teratas saja (semuanya terbagi 3 bagian)
• Tambahkan 800 ul iso-propanol dingin (etanol 96%) dan campur dengan membalik-balikkannya.
• Tempatkan pada suhu -80^oC selama 5 menit
• Centrifugasikan selama 10 menit
• Buang bagian beningnya hingga tinggal pelet DNA saja
• Tambahkan 250 ul etanol 70%
• Centrifugasikan selama 10 menit
• Buang bagian beningnya hingga tinggal pelet DNA saja
• Keringkan dalam speed vacum desicator
• Suspensikan pelet DNA dengan 25 25 ul DSW atau TE
• Gunakan 1 ul DNA tersebut untuk mengecek keberadaan plasmidnya